革兰氏染色步骤及注意事项_革兰氏染色步骤

1、操作步骤：1 ．涂片将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。

(资料图片仅供参考)

2、固定时通过火焰1一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

3、2 ．染色( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

4、( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

5、( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。

6、( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。

7、( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

8、以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

9、( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。

10、 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。

11、此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

12、原理：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

13、它是1884 年由丹麦医师Gr 二创立的。

14、革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。

15、细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

16、革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

17、革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye ）初染液；媒染剂（mordant ) ；脱色剂( decolorising agent ）和复染液（counter stain ）。

18、碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet ）。

19、媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ) 是常用的媒染剂。

20、脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95 ％的酒精（ethanol ）。

21、复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G ＋和G 一两大类群，常用的复染液是番红。

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